Características químicas

• Peso Molecular: 191,19 daltons
• Fórmula Molecular: C₁₀H₉NO₃.
• Classe Química: Ácido carboxilíco derivado do INDOL.

 

O 5-HIAA é um metabólito da serotonina. A serotonina é sintetizada a partir da dexcarboxilação do L-triptofano, um aminoácido essencial, conforme a reação:

 

Quando termina sua ação, a serotonina é oxidada (na realidade ela é desaminada) pela enzima monoamino-oxidase (MAO), que retira o grupamento NH₄⁺ transformando-a em
5-hidroxi-3-indol-acético, conforme a reação abaixo:

 

O grupo de alcalóides que contém o núcleo do indol ou derivados na sua estrutura consiste de compostos isolados de diversas drogas de diversas famílias de vegetais como ergot, rauvolfia, fava-de-calabar, noz vômica, vinca, entre outros. É o maior grupo de alcalóides com as mais importantes e diversificadas estruturas e usos terapêuticos. São derivados do triptofano ou do seu derivado descarboxilado, a triptamina. Estas bases contêm dois átomos de nitrogênio e são classificados em oito grupos distintos. Um grande número desses alcalóides são derivados da condensação da triptamina com uma porção monoterpênica derivada da secologanina fornecendo uma série de compostos como os alcalóides antileucêmicos da Catharanthus roseus, vincristina e vimblastina.

Pesquisa e Identificação de Alcalóides Indólicos.

  Pesquisa

1. Ferver cerca de 1g do fármaco em pó ou fragmentado com 10ml de H₂SO₄ à 1%, por dois minutos;
2. Deixar em repouso por alguns minutos e filtrar por algodão;
3. Resfriar o filtrado e alcalinizar com NH₄OH diluída até pH 9-10;
4. Adicionar 7ml de CHCl₃ e proceder a extração;
5. Decantar a camada clorofórmica para três cápsulas de porcelana e evaporar em banho-maria até secura.
6. Executar as reações de identificação.

Reação de Otto

• Ao resíduo da cápsula adicionar uma gota de H₂SO₄ concentrado e triturar com bastão;
• Adicionar cristais de bicromato de potássio;

Resultado: A reação é positiva para detectar presença de alcalóides indólicos se apresentar coloração inicialmente violácea que passa a vermelha.

Reação de Mandelin

• Ao resíduo da cápsula adicionar uma gota do Reativo de Mandelin (Vanadato de amônio a 1% em ácido sulfúrico concentrado) e triturar com bastão:

A reação é positiva para detectar presença de estricnina se apresentar coloração violácea a violácea-avermelhada.

 Reação de oxidação à cacotelina

• Ao resíduo da cápsula adicionar uma gota de HNO₃ concentrado e triturar com bastão;

Resultado: a reação é positiva para detectar presença de alcalóides metoxilados se apresentar coloração alaranjada.

 Preparo do reativo α-nitroso-b-naftol (também chamado de 1-nitroso-2-naftol).

Reagentes:	10,0g de b-naftol.  2,8g de hidroxido de sódio.  5,0g de nitrito de sódio.  4,9ml de ácido sulfúrico (d = 1,84).
Substâncias complementares:	Água gelada. Etanol.

Técnica:

1. Em becher, dissolver 2,8g de NaOH em 120ml de água fria e, com a solução ainda quente, dissolver na mesma, 10g de b-naftol.
2. Resfriar externamente a solução de b-naftolato de sódio, usando banho de gelo e sal grosso, até obter 0^oC.
3. Adicionar 5g de NaNO₂ e agitar com bastão de vidro.
4. Gotejar lentamente (durante uns 15 minutos), sobre a mistura em agitação, uma solução resfriada de 4,m9ml de ácido sulfúrico em 13ml de água, contida em funil de decantação mantendo a temperatura da mistura de reação cuidadosamente em torno de 0^oC. Verificar, ao final da adição, se a mistura está ácida com papel de vermelho do congo, e agitar a mistura ainda apor 45 minutos, mantendo a baixa temperatura.
5. Filtrar o precipitado em büchner, e lavar com muita água gelada.
6. Escorrer bem, lavar com alguns mililitros de álcool gelado, escorrer bem e
   secar ao ar ou em dessecador de ácido sulfúrico.

Constantes físicas:	P.M. = 173,16. P.F. = 110oC.
Características organolépticas:	Agulhas amarelas. Solubilidade em água fria 0,02% a 20oC; em álcool etílico 2,4% à 13oC. Solúvel em álcool etílico à quente, éter etílico e benzeno.

 Princípios da análise e uso atual

•  A análise qualitativa e quantitativa do ácido 5-hidroxi-indol acético, metabólito da serotonina encontrado na urina, foi descrito em 1955. O ensaio quantitativo, baseado na medição da absorbância a 540nm do cromóforo do cromóforo violeta formado quando este ácido reage com 1-nitroso-2-naftol em ácido nitroso foi o primeiro método descrito sendo um dos mais amplamente utilizado. Em uma modificação deste, se
  mistura 2-mercaptoetanol ao meio de reação para melhorar a especificidade do ensaio. Nesta modificação, a absorbância se mede em 590nm.
• A prova qualitativa para o 5-HIAA em urina é uma adaptação do primeiro ensaio quantitativo. Se baseia na reação do 5-Hidroxiindóis com 1-nitroso 2-naftol em ácido nitroso e faz-se, atualmente, como foi descrita originalmente.
• No mesmo ano em que se descreveu a metodologia do 1-nitroso 2-naftol foram publicados determinações qualitativas e quantitativas deste ácido em urina empregando o Reativo de Ehrlich(p-dimetilamino-benzaldeído em ácido clorídrico diluído). A cor azul produzida pode ser medida com um espectrofotômetro a 590nm, podendo também ser aplicada à quantificação do 5-HIAA.
• A espectrofluorometria tem sido empregada para a determinação deste ácido em urina e em líquido cefalorraquidiano (LCR). O procedimento espectrofluorométrico implica no isolamento do ácido por cromatografia em coluna de SephadexÒ G-10(?) ou de resina de troca iônica AG-1-X8. Logo, mede-se a intensidade da fluorescência diretamente ou depois de uma derivatização com o -ftalaldeído.
• A medição direta da fluorescência se realiza com excitação a 295 ou 300nm e emissão a 535 ou 540nm. Se a derivatização for feita antes da medição da fluorescência, a excitação é de 360 ou 355nm e a emissão se mede a 475 ou 480nm.
• Também são conhecidas técnicas cromatográficas para a determinação do 5-HIAA. A medição em urina se faz por cromatografia gás-líquido em uma coluna de silicone, empregando um detetor de condutividade térmica, logo que se dá a metilação com diazometano. Se tem publicado muitos procedimentos por cromatografia líquida de alta precisão (HPLC) para a medição do 5-HIAA em urina e LCR utilizando uma coluna C₁₈
  em fase inversa. Em alguns desses métodos se emprega a detecção fluorométrica do composto no derivado, enquanto em outros se utiliza a detecção eletroquímica para o ácido na urina e líquor.
• Também se tem aplicado técnicas de radio-imuno-ensaio (RIA) para a medição do ácido 5-hidroxiindolacético em tecidos, sangue, líquor e líquidos de perfusão.
• Em recentes comparações (através de enquetes) para controle de qualidade para urina realizado pelo Colégio de Patólogos Americanos (CAP), mostrou que mais de 95% dos laboratórios participantes empregam alguma forma de método espectrofotométrico com 1-nitroso-2-naftol (ou a-nitroso-b -naftol) para a determinação do 5-HIAA.

Métodos de referência e de eleição

• Para a detecção qualitativa do 5-HIAA em urina se tem empregado dois métodos. A técnica com o 1-nitroso-2-naftol é mais específico que o de Ehrlich e se emprega quase exclusivamente. O limite mínimo para detecção por prova de 1-nitroso-2-naftol é 30mg/l, ou seja, a sensibilidade é de 30mg/l.
• A prova utilizando o reativo de Ehrlich em urina tem uma sensibilidade de 12,5mg/l, mas não é específica para 5-HIAA. Outros derivados do indol, como 5-hidroxitriptamina e triptamina, reagem de forma semelhante.
• A técnica do RIA não tem sido muito utilizada devido a dificuldade de se obter anticorpos e antígenos marcados.
• O uso da cromatografia em gás para a determinação do 5-HIAA em urina não é muito difundida, visto que inclui extrações extensas e metilações em um tempo de análise relativamente prolongado.
• A detecção do 5-HIAA em urina e LCR por espectrofotometria após separação em coluna de SephadexÒ G-10 é considerado específico para este composto e apresenta uma sensibilidade de 50ng e um coeficiente de variação de de 4%. A recuperação é de 90 à 95% e não é difícil de fazer. No entanto, apesar de suas vantagens aparentes de
  sensibilidade e especificidade, este procedimento não se emprega a miúdos.
• Tem sido publicados muitos métodos de detecção e quantificação por HPLC do 5-HIAA em urina e liquor. Estes procedimentos apresentam uma sensibilidade de 25 a 30ng e constituem os métodos mais sensíveis. Também a vantagem de uma maior especificidade. Muitos compostos que interferem no método no método da 1-nitroso-2-naftol, como a serotonina, indol, triptamina, triptofano, ácido homovanilínico, p-hidroxiacetanilida, não interferem na análise por HPLC (cromatografia em gás-líquido).
• Lamentavelmente o equipamento utilizado neste tipo de determinação não se encontra disponível em qualquer laboratório da mesma forma que os requeridos para uma simples detecção espectrofotométrica. Se conhecem inúmeras variações da técnica do HPLC e não é possível indicar qual dos muitos procedimentos ou método de detecção é o melhor. Contudo, para a análise de líquidos ou tecidos que contem níveis baixos de 5-HIAA, a HPLC, especialmente com detecção eletroquímica é o método de eleição. A HPLC pode ser um método de referência para outros métodos de detecção deste ácido.
• A análise original por espectrofotometria do 5-HIAA em urina com formação de um cromóforo violeta logo após a extração e reação com o a -nitroso-b -naftol, ainda é o mais usado. Os inconvenientes deste método incluem um tratamento prévio da urina com dinitrofenilhidrazina para que esta reaja com os cetoácidos presentes e se elimine a interferência deles, uma dupla extração com clorofórmio se faz necessário para eliminar o ácido indolacético da urina e a interferência devida a diversas substâncias fenólicas presentes na urina, além de certas drogas. Neste método a r-hidroxiacetanilida, derivada da acetanilida ou drogas relacionadas, reagem de forma similar ao 5-HIAA. O acetaminofeno guaicolato de glicerila, fenacetina, mefenesina e metacarbamol originam metabólitos urinários que dão reação positiva com o a-nitroso-b-naftol. Por outro lado, a metenamida, fenotiazinas, proclorperazina e prometazina inibem o desenvolvimento da cor.
• Muitos problemas do método espectrofotométrico original podem ser superados mediante a adição de 2-mercaptoetanol ao a-nitroso-b -naftol e ácido nitroso à mistura de reação. O mercaptoetanol elimina a interferência dos fenóis, ácido indol-3-acético, mefesina, ácido homovainilínico, 5-hidroxitriptamina, p-hidroxiacetanilida, ácido p-hidroxifenilacético e guaicolato de glicerila. Também converte o cromóforo violeta em um tom de cor azul mais intenso.
• A comparação do método espectrofotométrico original e de sua modificação com 2-mercaptoetanol com o método de HPLC que emprega detecção fluorométrica apoia o argumento de que o ensaio não modificado apresenta consideráveis interferências, as quais não aparecem o método modificado. A correlação entre o ensaio espectrofotométrico modificado e o de HPLC é boa (coeficiente de correção = 0,9303, número de determinações, n = 44). A linha de regressão linear está representada pela equação:

Ensaio espectrofotométrico modificado = 0,85 X ensaio HPLC + 0,11.

• As recentes enquetes do CAP indicam que a precisão inter-laboratórios não é muito boa. Para níveis dentro do intervalo de referência, os coeficientes de variação em percentagem (%), inter-laboratórios, oscilavam entre 22 e 55%, enquanto que para níveis mais elevados de 5-HIAA (100 a 200mg/l), se encontravam entre 9 a 25%. O uso da HPLC automatizada (CG-MS acoplada à computador), poderia proporcionar análises mais reprodutíveis.
• Dada á disponibilidade do equipamento, o método espectrofotométrico modificado com mercaptoetanol é provavelmente o método de eleição para os laboratórios que realizam análises urinárias de rotina. Se o laboratório dispuser de um equipamento de HPLC, este será o método de escolha.

 

Amostra

Uma amostra de urina tomada ao acaso é apropriada para a detecção do 5-HIAA.

Para a análise quantitativa deste ácido se requer uma amostra de urina de vinte e quatro horas recolhida de um frasco com 12g de ácido bórico ou 10ml de Cl 6M (Molar). A amostra é estável por uma semana a temperatura ambiente e mais de um mês a 2-6^o C. Alguns alimentos como a berinjela, a banana, a ameixa, as nozes, os ananás, são ricos em serotonina e devem ser suspensos em serotonina e devem ser suspensos três a quatro dias antes da tomada da amostra, pois poderão dar falsos resultados positivos.

Procedimento: método espectrofotométrico para o ácido 5-hidroxi-indol-acético

Princípio

Prova Qualitativa: Ao se adicionar a -nitroso-b -naftol em ácido nitroso na urina, se desenvolve uma cor púrpura. específica para os 5-hidroxiindóis. Os cromógenos interferentes podem se extraídos com dicloro-etileno (ou dicloreto de etileno).

Prova Quantitativa:

• o 5-HIAA deve ser extraído com éter da urina acidificada.
• Para favorecer a passagem deste ácido para os solventes orgânicos se adiciona sal (NaCl) à urina.
• O 5-HIAA é recuperado da fase etérea por reextração com buffer de fosfato (tampão de fosfato) à pH 7,0.
• Os fenóis urinários não são ionizados em pH 7,0 e permanecem na fração etérea. Mediante a adição do 1-nitroso-2-naftol em ácido nitroso se obtém um cromógeno violeta que por adição de 2-mercaptoetanol se transforma num cromógeno azul.
• O mercaptoetanol reduz os compostos coloridos formados pelo ácido indolacético e pelos fenóis, com exceção dos derivados de ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA), transformados em incolores à 590nm.
• O tratamento com mercaptoetanol também elimina a interferência devida a mefesina e ao guaicolato de glicerila.
• Ademais, a cor azul produzida pela reação do mercaptoetanol com os cromógenos do 5-HIAA, duplica o coeficiente de extinção molar com relação ao cromógeno violeta.
• A absorbância máxima para o produto de cor azul se encontra em 645nm. Toda via, esta longitude de onda não obedece às Leis de Beer ao longo de um intervalo adequado de concentrações do 5-HIAA. Se obtém um intervalo linear mais conveniente a 590nm.

Reativos

Prova qualitativa

1. a -nitroso-b-naftol, 1g/l em etanol à 95% (5,75mmol/l). Dissolver 0,5g de 1-nitroso-2-naftol em etanol à 95% e completar para 500ml com o mesmo álcool. Conservar em frasco âmbar, em geladeira por no máximo um mês.
2. Ácido sulfúrico 1 mol/l. Adicionar 56ml de ácido sulfúrico 17,8mol/l (95%) a aproximadamente 800ml de água deionizada em um balão volumétrico de l000ml. Agitar com cuidado e completar o volume para um litro.
3. Nitrito de sódio, 25g/l (0,36mol/l). Preparar uma vez por mês e conservar entre 2 e 6^o .
4. Ácido nitroso (60mmol/l). Preparar no momento do uso, adicionando 1ml da solução de nitrito de sódio em 5ml de ácido sulfúrico 1mol/l.
5. Dicloreto de etileno. Redestilar o dicloreto de etileno P.A. ou utilizar o P.A. “destilado sobre vidro”.

Prova quantitativa

• Ácido clorídrico, 1mol/l. diluir 85ml de HCl concentrado a aproximadamente 800ml de água deionizada em um balão volumétrico de 1000ml. Agitar com cuidado e completar o volume para 1000ml. Estável por dois anos à 25^o C.
• Cloreto de sódio P.A.
• Éter sulfúrico. Eliminar os peróxidos do éter por agitação funil de separação, com a metade de seu volume de solução de sulfato ferroso (59g/l) seguida por lavagens com água deionizada. Preparar somente no momento do uso.
• Buffer de fosfato (tampão fosfato), 0,1mol/l, pH 7,0. Utilizar 2,59g de fosfato de potássio (monobásico) e 8,31g de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado ou 4,4g de fosfato de sódio dibásico anidro, por 500ml de solução. Ajustar o pH segundo a necessidade, utilizado pHmetro. Estável por dois meses à 2-6^oC.
• a -nitroso-b-naftol, 2g/l em etanol a 95% (11,5mmol/l). Conservar em frasco âmbar. Cuidado: solução cancerígena. O 1-nitroso-2-naftol P.A. é adequado para o uso analítico embora possa dar um branco elevado. É possível obter um reativo mais puro
  dissolvendo-se 20g deste composto em 100ml de etanol fervente, adicionando carvão ativado e filtrando por duas horas em papel Whartman número 1. Resfriar a mistura durante 16-18 horas e filtrar o precipitado cristalinopardo em um filtro de Büchner. Pode ser secado em temperatura ambiente, de preferência ao abrigo da luz. ou em estufa à vácuo. O rendimento é de 10 a 12g.
• Nitrito de sódio, 25g/l (0,36mol/l). Preparar uma vez por mês. Conservar entre 2-6^oC.
• Ácido nitroso (0,013mol/l). Preparar no momento do uso adicionando 1ml da solução de nitrito de sódio à 25ml de Hcl 1mol/l.
• Mercaptoetanol, 250ml/l (3,57mol/l). Preparar em capela. Estável por um ano entre 2 e 6^oC.
• Acetato de etila. Redestilar o acetato de etila P.A. ou empregar o qualidade “destilado sobre vidro”.
• Solução padrão de ácido 5-hidroxiindolacético, 250mg/l (1,3mmol/l). Colocar 25mg de ácido 5-hidróxidoindolacético (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO.) em um balão volumétrico de 100ml e dissolvem em 100ml de ácido clorídrico 0,1M (Hcl 1mol/l diluido em 1:10 de água). estável durante um mês à 2-6^oC, em frasco âmbar.

 

Tabela I – condições de reação para provas qualitativas de 5-HIAA:

 

Condição:	Prova qualitativa:
Temperatura	ambiente
Tempo de reação	5 minutos
Volume de amostra	0,2ml (200m l)
Fração de volume de amostra	0,1ml
Concentração final do reativo	1-nitroso-2-naftol: 1,44mmol/l HNO3: 15,0mmol/l H2SO4: 0,28mol/l
Sensibilidade	30mg/ml

 

Método padrão de determinação do Ácido 5-hidroxiindolacético. 10mg/l
(52m mol/l).

 

Diluir 4,0ml de solução padrão em 100ml de solução aquosa de tiouréia
(1g/l). Estável por duas semanas à 2-6^oC em frasco âmbar.

 

 

Ensaio

 

Prova qualitativa

 

1 – Processar um controle de urina normal como comparação.

2 – Pipetar em tubo de ensaio, 0,2ml de urina, 0,8ml de água deionizada e
0,5ml de 1-nitroso-2-naftol e agitar para completa mistura.

3 – Adicionar 0,5ml de ácido nitroso e agitar novamente.

4 – Deixar à temperatura ambiente por cinco minutos.

5 – Adicionar 5ml de dicloreto de etileno (ou dicloro-etileno) e agitar.

6 – Se observar turbidez, centrifugar novamente

7 – Uma cor púrpura na parte superior indica reação positiva. Com
a urina normal não se observa esta coloração, porém, é possível observar
uma cor amarelada.

 

Tabela II – Condições de reação para prova quantitativa para 5-HIAA.

 

Condição	Ensaio espectrofotométrico	Ensaio HPLC.
Temperatura	37 e 80-100o	Ambiente.
PH	7,0	—
Tempo de reação	3 a 5 minutos	10minutos
Volume de amostra	5ml (2ml de extrator)	100m
Fração de volume de amostra	0,54 (para extração)	0,022 (para extração)
Concentração final dos reativos	1-nitroso-2-naftol 1,55mmol/l HNO3 3,5mmol/l H2SO4 028mol/l 2-mercaptoetanol 193mmol/l
Linearidade	30mg/l	3m g (injetados)
Precisão (CV)	4%	5%

 

Prova Quantitativa

 

Equipamentos: espcctrofotômetro com divisões de bandas £
10nm; estufa de Pasteur (37^o C) e um agitador mecânico.

1 – Medir o volume de urina da amostra de urina de 24 horas, em
mililitros (ml).

2 – Colocar 5ml de urina em tubo de centrífuga de 50ml com tampa de
vidro.

3 – Colocar 5ml de água deionizada em um tubo de centrífuga com tampa de
vidro, para usar como branco.

4 – Colocar 5ml da solução estoque de 10ml/l em tubo de centrífuga, para
usa como padrão.

5 – Adicionar a todos os tubos 5ml de Hcl 1mol/l, cloreto de sódio em
solução saturada(aproximadamente 4g) e 25ml de éter.

6 – Agitar durante 5 minutos e centrifugar.

 

7 – Transferir 20ml dos extratos etéreos a tubos de centrífuga de
50ml com tampa de vidro.

8 – Adicionar 4ml de buffer de fosfato (tampão de fosfato). Agitar
durante 5 minutos e centrifugar.

9 – Aspirar a camada superior de éter.

10 – Transferir alíquotas de 2ml da camada aquosa a tubos de ensaio de
13X100mm., tomando o cuidado de não carrear solução etérea. Não descartar
a solução aquosa restante até finalizar as análises.

11 – Adicionar 0,5ml de 1-nitroso-2-naftol a todos os tubos e misturar.

12 – Adicionar 1ml de ácido nitroso a cada tubo e misturar.

13 – Incubar todos os tubos à 37^o C durante 5 minutos

14 – Adicionar 0,2ml de 2-mercaptoetanol a todos os tubos e misturar bem.

15 – Incubar todos os tubos em banho-maria à 85-100^oC, durante
5 minutos.

16 – Esfriar os tubos à temperatura ambiente.

17 – adicionar 5,0ml de acetato de etila a todos os tubos. Tampar com
tampa de borracha e agitar energicamente durante meio minuto. Deixar
separar as fases.

18 – Aspirar a camada orgânica (camada superior).

19 – Ler a absorbância (A) a 590nm da camada inferior dos padrões e
amostras desconhecidas contra o branco.

Cálculos:

 

Notas:

 

1 – Na prova qualitativa se observa uma cor púrpura para níveis de 5-HIAA
de apenas 30 a 40mg/l. Para níveis mais elevados a cor é mais intensa,
chegando a quase negro para concentrações superiores à 300mg/l.

2 – A formação de cor na prova qualitativa pode ser inibida por condições
que provocam a excreção de grande quantidades de cetoácidos.

3 – A p-hidroxiacetanilida reage em forma similar ao
5-HIAA, porém pode ser encontrado na urina somente após a administração de
acetanilida e de drogas pertencentes ao mesmo grupo.

4 – A formação de uma intensa coloração roxa no procedimento 11 da
determinação quantitativa pode indicar a presença de metabólitos do
guaiacolato de glicerila presente em antitussívegos e drogas relacionadas.

5 – Se absorbância (A) da amostra desconhecida for três vezes maior que
da solução padrão, deve-se repetir o desenvolvimento da cor com 0,2ml de
extrato em tampão fosfato do procedimento 10. Adicionar 1,8ml deste tampão
à amostra e continuar com a análise. Para realizar o cálculo, multiplicar
o valor obtido mediante a fórmula por 10, para corrigir a diluição.

6 – Tem sido encontradas interências negativas devidas à presença de
fenotizainas e ácido homogentísico no método do 1-nitroso-2-naftol
modificado. Estes compostos não tem sido analisados debaixo das mesmas
condições aqui apresentadas.

 

 

 

DETERMINAÇÃO DO 5-HIAA POR HPLC.

 

 

 

Princípio

 

O ácido 5-hidroxiindolacético junto com o padrão interno misturado se
purifica mediante colunas de extração C₁₈. A franção
que contem o 5-HIAA e o padrão interno se injeta em um sistema de HPLC. O
ádico e o padrão interno se separam e são determinados posteriormente com
um detetor eletroquímico

 

 

Reativos

 

Água deionizada, destilada. Deve ser empregada para extração de
todos os reativos.

 

Colunas de extração C₁₈.

 

Ácido acético (6mol/l). Diluir 34,5ml de ácido acético glacial em
100ml de água. Estável por um ano à temperatura ambiente.

 

Solução de hidróxido de amônio (6mol/l). Diluir 39,7ml de
hidróxido de amônio concentrado em 100ml de água. Estável por um mês à
temperatura ambiente.

 

Solução de buffer de acetato (0,1mol/l, pH 5,0). Adicionar 1,5ml
de ácido acético 6M e 1,3g de acetato de sódio em balão volumétrico de
250ml e completar com água. Estável por um ano à temperatura ambiente.

 

Solução estoque de ácido 5-hidroxiindolacético 0,5g/l (2,62mmol/l). Dissolver
25mg de 5-HIAA em 40ml de água. Ajustar o pH a menos de 3,0 com Hcl conc.
Completar o volume para 50ml. Estável por um mês à 4^oC.

 

Solução padrão de Ácido 5-Hidroxiindolacético, 5mg/l (0,0262mmol/l).
Diluir a solução estoque à 1:100 com água destilada e deionizada. Preparar
a cada dia.

 

Solução estoque de padrão interno, 0,5g/l (2,44mmol/l). Dissolver
12,5mg de ácido 5-hidroxi-3-indolpropiônico (5-HIPA) em 20ml de
água. Ajustar o pH para baixo de 3,o com HCl concentrado. Completar o
volume para 25ml. Estável por um mês à 4^oC.

 

Solução padrão interno de trabalho, a 5mg/l (0,244mmol/l). Diluir
a solução estoque de 5-HIPA para 1:100 em água destilada. Preparar
a cada dia.

 

Fase móvel usada em HPLC. Adicionar os seguintes reagentes a um
becher ou erlenmeyer de dois litros, contendo 1760ml de água
destilada: 50,7ml de hidróxido de amônio concentrado; 64,7ml de ácido
acético glacial e 0,2g de EDTA dissódico. Ajustar o pH para 5,1 com
ácido acético 6M ou NH₄OH 6M. Adicionar imediatamente 325ml de
metanol. Misturar e filtrar. Desgaseificar a fase movel antes de
usar. Preparar à cada dia.

 

 

Ensaio

 

Equipamento: cromatografo de fase gasosa, detetor eletroquímico,
registrador para papel.

 

As colunas de extração C₁₈ Baker devem ser
condicionadas antes de se adicionar as amostras. Devem ser lavadas com o
dobro do volume da coluna com metanol qualidade HPLC, debaixo de vácuo. A
medica em que o nível do metanol se aproxima da parte superior do patamar,
deve ser interrompido o vácuo. Imediatamente após a lavagem com metanol,
se adiciona água deionizada em volume igual. O vácuo deve ser
desconecatado logo após a aspiração total da água através da coluna. Se a
coluna secar antes da introdução da amostra, deve ser recondicionada
novamente.

 

1 – Pipertar, em tubo de ensaio de 13X100mm, 3,9ml, 3,7ml e 3,5ml de
tampão de acetato nos tubos rotulados de padrão 1,2 e 3.

2 – Pipetar 200, 400 e 600m l do padrão de
trabalho do 5-HIAA nos tubos marcados 1;2 e 3, respectivamente.

3 – Pipetar 100m l de urina em tubos
marcados como controle.

4 – Pipetar 4ml de tampão acetato de sódio nos tubos controle e de
amostra.

5 – Pipetar 400m l de padrão interno de
trabalho do 5-HIPA em todos os tubos.

6 – Lavar as colunas de extração C₁₈ Baker com 3ml de
metanol e 3ml de água.

7 – Adicionar a amostra adequada a coluna de extração e recolher o
efluente em tubos de ensaio.

8 – Adicionar 3ml da fase móvel as colunas, 1ml por vez e recolher os
efluentes em tubos de ensaio.

9 – Misturar os efluentes dos passos 7 e 8, agitar em um “vortex”e
injetar 50m l dos padrões, controles e
amostras desconhecidas ao sistema cromatográfico.

10 – Condicões experimentais para HPLC:

 

Potencial do detetor eletroquímico	0,50V
Sensibilidade do detetor	20nA/V
Velocidade do fluxo	0,9ml/minuto
Velocidade do Registro	0,25cm/minuto
Tempo de retenção	4 a 5 minutos para 5-HIAA   7 a 8 minutos para 5-HIPA

 

Cálculos:

 

A quantidade de 5-HIAA nos tubos padrões 1;2 e 3 são representados pela
relação das alturas dos picos de 5-HIAA/5-HIPA para se estabelecer uma
curva de calibração por método de ajuste algébrico da reta. A quantidade
de 5-HIAA (em microgramos) presente em 100m l
de urina se obtem a partir do ajuste algébrico inicial. O resultado final
expresso em mg/24h se calcula mediante a equação:

 

m g de 5-HIAA X VT ml/24h X 1mg
= mg de 5-HIAA/24h.

0,1ml 1000m g

 

De onde VT é o volume total.

 

 

INTERVALO DE REFERÊNCIA

 

Prova qualitativa: Negativa (menos de 30 a 40mg/ml, 157 a 209m mol/l).

 

Prova quantitativa: 1,8 a 6,0mg/24h (9,4 a 31,4m
mol/24h). A excreção de 5-HIAA independe de idade, sexo, etnia,
etc..

 

INTERPRETAÇÃO

 

As análises de 5-HIAA são solicitadas para descartar a presença de
tumores carcinóides. Este tipo de tumor é um dos mais comuns que aparecem
no intestino delgado, originando-se das células de Kultschitzsky das
cristas de Lieberkühn. Também pode se apresentar no pâncreas, apêndice
vermiforme, reto e ovário.

As manifestações clínicas mais frequentes do tumor estão associadas com a
obstrução intestinal ou perda de sangue retal. Raras vezes as
manifestações iniciais são associadas com a síndrome carcinóide,
que em ordem de frequência são o enrigecimento, diarreia, insuficiência
cardíaca severa e broncoconstrição (crise asmatiforme).

Os tumores carcinóides a muido formam metástases no gânglios linfáticos
regionais e no fígado. A maior frequência das metástases de gânglios se
observa nos carcinóides de cólon. Os sintomas da síndrome carcinóide
normalmente aparecem depois que o tumor formou metástases no fígado. Se
pensa atualmente que os sintomas desta síndrome se devem a quantidades
excessivas de 5-HIAA que são secretadas pelo tumor. Em um estudo, a metade
dos pacientes com metástase hepática apresentaram características de
síndrome carcinóide e níveis urinários elevados de 5-HIAA. Nenhum paciente
sem metástase hepática de um tumor carcinóide de cólon apresentava níveis
elevados do 5-HIAA

A excreção excessiva do 5-HIAA é o indicador bioquímico mais específico
de tumor carcinóide. Se bem que os pacientes com estes tumores excretam de
5 a 50 vezes a quantidade normal de 5-HIAA, esta excreção é variável e a
miudo requer medições consecutivas para estabelecer o diagnóstico. Em caso
de níveis elevados limítrofes de 5-HIAA, deve ser eliminado da dieta do
paciente os alimentos ricos em serotonina. A reserpina que estimula a
liberação da serotonina de reseva pode causar elevações falsa do 5-HIAA

Podem ser encontrados níveis levemente elevados de 5-HIAA em urina de
outras enfermidades do trato gastrointestinal, como no espru celíaco,
espru tropical e enfermidade de Whipple, assim como no
carcinoma de célunas de avena dos brônquios. Se tem sugerido que a
discreta elevação dos níveis urinários boservadas em pacientes com espru
não tropical são atribuidas aso 5-HIAA liberado por células do trato
gastrointestinal como resultado de uma motilidade intestinal alterada. Em
21 pacientes com espru não tropical foram encontrados níveis do 5-HIAA
entre 5,8 a 12mg/24horas, com uma média de 8,6mg/24horas (o limite
superior normal neste estudo foi de 2 a 9ng/24horas).

Em pacientes com transtornos renais podem ser observados níveis baixos
falsos do 5-HIAA.

Em pacientes com distúrbios psicóticos, especialmente nas esquizofrenias,
o 5-HIAA está elevado na urina. Constitui-se em importante ferramenta para
se determinar se uma psicose é endógena ou exógena.